影響western blot實(shí)驗(yàn)的因素你知道多少！

Western Blot實(shí)驗(yàn)又稱蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)），它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。

Western blotting是一個步驟繁多的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中的每一步都會對最后的結(jié)果產(chǎn)生影響，下面將為你總結(jié)一些影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素：

1. 樣品質(zhì)量

所抽取樣品的蛋白含量，蛋白變性是否充分等等，還有，蛋白樣品的PH值是否在7~8之間。這會直接影響到樣品濃縮的效果。此外，蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會對最終結(jié)果的可靠性有影響。

2.凝膠質(zhì)量

不連續(xù)SDS-PAGE膠對凝膠的要求較高，具體的影響因素有：（1）分離膠的PH值應(yīng)在8.8左右，而濃縮膠的PH應(yīng)在6.8左右，最好不要差過0.5個PH單位，因?yàn)檫@個PH條件是保證電泳液中的甘氨酸不電離的必要條件，也是保證能充分壓縮樣品的前提。因此，制備凝膠的時候所用Tris-HCl緩沖液的PH值是否穩(wěn)定是很重要的。（2）用丙烯酰胺的純度和凝膠聚合時間，不純的丙烯酰胺會含有丙烯酸，它會影響到凝膠內(nèi)部局部PH環(huán)境，因此會影響電泳的效果，沒有聚合充分的凝膠會含有游離的丙烯酰胺，也會影響到局部PH環(huán)境，它們還會與蛋白上的氨基、巰基以及酚羥基反應(yīng)影響蛋白的泳動。凝膠聚合時間以分離膠>45min，濃縮膠>20min為宜。此外，單體放置時間過長也會造成丙烯酸的累積。（3）凝膠母液混合是否均勻也會影響到凝膠濃度的分布。（4）配備的母液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例也會影響到網(wǎng)孔的大小，因此也會對電泳的質(zhì)量有影響。（5）APS及TEMED的加入量，APS極易潮解而失去活性，因此最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，APS不宜加入過多，否則會氧化蛋白樣品。（6）點(diǎn)樣孔底部要平整。

3. 點(diǎn)樣

樣品盡量不要與電泳液混合，這樣能提高濃縮的效果，因?yàn)殡娪疽篜H值為8.3，而樣品為7.5，混合后會影響到樣品的PH值，進(jìn)而影響濃縮效果。因此，建議點(diǎn)樣最好用長qiang頭，或者加樣器，輕輕的將樣品加到孔的底部。還有，加樣之前最好先沖洗一下加樣孔底部，減少沒有聚合的丙烯酰胺的影響。盡量從加樣孔的中間點(diǎn)樣，這樣能使得樣品在加樣孔中的濃度分布盡量均勻，這也會對最終蛋白條帶的形狀有影響的。加樣量也不能過高或過低，過高會影響條帶的形狀，過低不利于后面的雜交反應(yīng)。

4. 電泳緩沖液

盡量用新鮮配制的。這樣能保證PH值和離子強(qiáng)度的穩(wěn)定。

5. 電壓條件

電壓過高，一方面會使凝膠溫度上升，改變凝膠內(nèi)部PH值，甚至?xí)斐扇苣z，另一方面，電流過大也不利于蛋白分子的分離，容易造成條帶變形，電壓過低，又會有樣品擴(kuò)散的影響。我們經(jīng)常用的濃縮時80V，分離時100V比較好，條帶很平。

6. 轉(zhuǎn)膜

先是膜的選擇，主要從實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)要求來考慮。例如，要做分子量小于20kD的小蛋白，0.45μm的NC膜是不可取的，因?yàn)檫@樣可能會使得蛋白因透過膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白量不確定，從而影響到最終結(jié)果的可靠性。而如果所分離的蛋白需要進(jìn)行測序，則非PVDF膜不可，因?yàn)橹挥蠵VDF膜才能經(jīng)受住嚴(yán)酷的清洗條件。其次是轉(zhuǎn)膜方法的選擇。主要有半干法轉(zhuǎn)膜和濕法轉(zhuǎn)膜。半干法操作要求高，但效率也高。濕法操作要求相對低，花時間多一些。

7. 抗體雜交與底物顯色

一抗盡量選擇小鼠或者兔來源的單克隆抗體，還有要注意所用的抗體是否能夠識別變性條件下的目標(biāo)蛋白；二抗一般都是效價很高的，只要室溫下雜交1小時就可以了，適當(dāng)延長也是可以的。另外，要選擇靈敏度較高的化學(xué)反應(yīng)底物。如英格恩生物的超敏型ECL發(fā)光液Enlight-Plus，檢測級別可達(dá)pg級，發(fā)光時間長，穩(wěn)定。