自去年10月開始，分子生物學(xué)家Katsuhiko Hayashi就陸陸續(xù)續(xù)收到了許多夫妻的郵件，這些夫妻大多人到中年，仍然在為了一件事情焦急：要一個孩子。其中有一位英國的更年期婦女，希望到他位于日本京都大學(xué)的實驗室，在他的幫助下懷上孩子，她寫道：“這是我*的愿望。”

這些請求開始于Hayashi一篇文章的發(fā)表——他原以為只有發(fā)育生物學(xué)家才會對他的實驗結(jié)果感興趣。在體外條件下，利用小鼠的皮膚細胞創(chuàng)造可以發(fā)育成精子和卵子的原始生殖細胞（PGCs）。為了證明這些實驗室培養(yǎng)的原始生殖細胞與自然發(fā)育而成的原始生殖細胞類似，他利用它們生成了卵子，進而創(chuàng)造小鼠生命。他表示，這個創(chuàng)造出來的小鼠生命僅僅是他研究的一個“副產(chǎn)品”，他的研究將意味著更多——利用不孕婦女的皮膚細胞為她們提供可受精的卵細胞。與此同時他還提出，男性的皮膚細胞也可以用來創(chuàng)造卵子，同樣，女性的皮膚細胞也可以生成精子。（事實上，研究結(jié)果發(fā)表后，許多同性戀發(fā)郵件給Hayashi ，索要更多的信息。）

盡管這是一項創(chuàng)新研究，但是公眾的廣泛關(guān)注還是令Hayashi和他的教授Mitinori Saitou感到非常驚訝。他們花了十多年不斷挖掘哺乳動物配子產(chǎn)生的微妙細節(jié)，然后在體外條件下重新創(chuàng)建該過程——一切都是為了科研，而非醫(yī)療。現(xiàn)在他們的方法使研究人員能夠創(chuàng)建無限的原始生殖細胞，這種在以前很難獲得的珍貴細胞的正常供應(yīng)有助于推動哺乳動物生殖研究。

但是，當(dāng)他們將這個科學(xué)挑戰(zhàn)自小鼠到猴子，再到人類推進時，這一過程被公眾定義為治療不孕不育的過程，于是相關(guān)的道德爭議隨之出現(xiàn)。“毫無疑問，他們在小鼠身上給這一領(lǐng)域帶來了重大的改變，” 洛杉磯加州大學(xué)的生育專家Amander Clark說，“但是，在這項技術(shù)展示它的實用性之前，我們必須討論一下使用這種方式創(chuàng)造配子的倫理問題。”

回到zui初

在小鼠體內(nèi)，胚胎發(fā)育一周后，便出現(xiàn)約40個左右的原始生殖細胞。這個小小的細胞團進而在雌性小鼠體內(nèi)形成成千上萬的卵細胞，在雄性小鼠體內(nèi)每天都能生成幾百萬個精細胞，并能夠遺傳小鼠的全套遺傳信息。Saitou想要了解在這些細胞發(fā)育過程中受到了那些信號的控制。

在過去的十年中，Saitou已經(jīng)通過辛苦研究確定了幾個基因——包括Sla, Blimp1 和Prdm14 ——這些基因的某種組合在某些時候?qū)τ赑GCs的發(fā)育起到了至關(guān)重要的作用。利用這些基因作為標記，可以從其他細胞中篩選原始生殖細胞以觀察這些細胞的變化。2009年，在日本神戶的RIKEN發(fā)育生物學(xué)中心，他發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)條件適當(dāng)時，在的時間加入骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4），可以胚胎干細胞轉(zhuǎn)化為原始生殖細胞的。為了驗證這一發(fā)現(xiàn)，他向胚胎干細胞提供高濃度的BMP4，結(jié)果顯示，幾乎所有的胚胎干細胞都變成了PGCs。他和科學(xué)家們都預(yù)計這一過程非常復(fù)雜。

人造小鼠生殖細胞產(chǎn)生小鼠胚胎的過程（點擊圖片查看大圖）

Saitou的方法嚴格遵循了自然過程，這與其他從事類似研究的人形成了鮮明的對比，以色列魏茨曼科學(xué)研究所的干細胞專家Jacob Hanna說。許多科學(xué)家嘗試通過信號分子轟擊干細胞在體外創(chuàng)造特定類型的細胞，然后篩選細胞混合物得到他們想要的細胞。但是他們忽略了這些細胞的自然形成過程和這些人造細胞與自然形成細胞的相似程度。Saitou找出了形成生殖細胞所需的條件，去除多余的信號干擾并將每個過程的時間控制，給他的同事們留下了深刻的印象。英國謝菲爾德大學(xué)的干細胞生物學(xué)家Harry Moore將這種生殖細胞發(fā)育的重現(xiàn)視為一場“勝利”。

到了2009年， Saitou在小鼠生殖細胞出現(xiàn)之前從外胚層取了一些細胞，這成了研究的起點。但是想要真正掌握這個過程中，Saitou希望從細胞培養(yǎng)開始。

當(dāng)時正值Hayashi從英國劍橋大學(xué)回到日本，和Saitou一樣，Hayashi在該領(lǐng)域Azim Surani英國的實驗室里完成了4年的研究。Surani盛贊這兩位科學(xué)家說，他們的“氣質(zhì)、風(fēng)格和解決問題的方法能夠相互補充”。 Saitou “處理事情時很有系統(tǒng)性、完成目標一心一意”，而Hayashi“工作時更有直覺、視角更廣闊、處理問題方法相對更加寬松”，他說。“他們確實形成了一個非常強大的團隊。”

Hayashi加入了Saitou京都大學(xué)的團隊，他很快就發(fā)現(xiàn)，那里不同于劍橋。在京都大學(xué)，Hayashi用在理論討論上的時間比曾經(jīng)少得多，而更多的時間都花在實驗上。他說“在日本，我們只管‘做’，這有時是非常低效的，但有時又醞釀著巨大的成功”。

Hayashi同樣以外胚層細胞作為起點，但與Saitou不同的是，他試圖培養(yǎng)一個能夠產(chǎn)生原始生殖細胞的穩(wěn)定細胞系。可惜這種方法沒有奏效。Hayashi借鑒其他研究結(jié)果——一個關(guān)鍵調(diào)控分子（activin A）和生長因子（bFGF）可以將培養(yǎng)的早期胚胎干細胞轉(zhuǎn)化成類似于外胚層細胞的細胞類型。這引發(fā)了Hayashi將這兩個因素結(jié)合起來的想法，誘導(dǎo)胚胎干細胞分化為外胚層，然后采用Saitou之前的方法把這些細胞成為的PGCs。通過這種新的方法，他zui終獲得了成功。

為了證明這些人造的原始生殖細胞是真實的拷貝，他們必須證明這些細胞可以進一步發(fā)育成精子和卵子。這一進程是非常復(fù)雜和難以理解的。所以研究小組將這一工作留給了自然——Hayashi將PGCs植入無法產(chǎn)生精子的小鼠的睪丸，觀察這些細胞是否會發(fā)育。Saitou認為，這是可行的，但還是感到有些擔(dān)憂。當(dāng)實驗進行到第3或4只小鼠時，他們發(fā)現(xiàn)小鼠的輸精管里充滿了精子。“這一切都發(fā)生得恰如其分，我知道他們會產(chǎn)生幼仔，”Hayashi說。研究小組將這些精子注入卵細胞中并植入雌性小鼠的胚胎，結(jié)果產(chǎn)生了大量的雌性和雄性后代。

他們利用誘導(dǎo)多能干細胞（iPS）進行反復(fù)的實驗，成熟的細胞被重新編程為胚胎狀態(tài)。此外，精子被用于生物試劑幼仔，證明它們具有基本功能——這是干細胞分化領(lǐng)域的罕見成就。Clark說：“這是整個多能性干細胞研究領(lǐng)域里在培養(yǎng)皿中生成全功能細胞類型少有的成功案例之一。”

他們預(yù)計形成卵細胞更復(fù)雜，但是在去年，Hayashi在體外條件下制作有正常著色的原始生殖細胞并轉(zhuǎn)入白化小鼠的卵巢，將產(chǎn)生的卵細胞體外受精后植入代孕。當(dāng)透過幼崽半透明的眼瞼看到黑色的眼睛時，他知道這一切又成功了。

生殖細胞的回饋

目前，許多研究人員已經(jīng)能夠復(fù)制驗室培養(yǎng)原始生殖細胞的過程。人造原始生殖細胞特定用于表觀遺傳學(xué)研究：通過修飾DNA確定哪些基因表達。zui常見的修飾就是為DNA堿基加上甲基，這些修飾在有些情況下，能夠反映生物所經(jīng)歷的歷史過程。與其它類型的細胞類似，表觀遺傳標記改變了原始生殖細胞在胚胎發(fā)育過程中的命運，但原始生殖細胞有個與眾不同的特點，就是當(dāng)它們發(fā)育成精子和卵子后，表觀遺傳標記被擦除。這就允許細胞創(chuàng)建能夠形成任何類型細胞的受精卵。

表觀遺傳微妙變化中出現(xiàn)錯誤將會導(dǎo)致不孕不育并出現(xiàn)器官故障，如如睪丸癌。Surani和Hanna的團隊已經(jīng)利用人造原始生殖細胞研究不同酶在表觀遺傳調(diào)控中的作用，也許有一天，能夠解答表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)如何參與疾病調(diào)控。

事實上，體外產(chǎn)生的原始生殖細胞可以為研究提供數(shù)百萬個細胞，而不是供科學(xué)家研究了40個左右，這些細胞可以通過解剖早期胚胎獲得。Hanna說：“這是一個大問題，因為我們這里有這些稀有的原始生殖細胞正在經(jīng)歷我們尚不了解的全基因組表觀遺傳變化。”“體外模型為科學(xué)家們提供了的方便，” Clark表示認同。

研究意義

但是Hayashi和Saitou沒有辦法向乞求幫助的不孕夫妻提供幫助。在這種方法被運用在研究之前，還有許多問題需要梳理。

Saitou和Hayashi發(fā)現(xiàn)，雖然運用他們的技術(shù)所產(chǎn)生的后代通常似乎是健康和大量的，但這些后代產(chǎn)生的原始生殖細胞并生不*“正常”。 第二代原始生殖細胞產(chǎn)生的卵細胞往往是脆弱、畸形的，并且從支持它們生長的組織上脫離。當(dāng)受精時，卵細胞內(nèi)部會分為三組染色體，而不是正常的兩組，體外受精的成功率也只有正常原始生殖細胞的三分之一。哈佛醫(yī)學(xué)院從事表觀遺傳學(xué)研究的Yi Zhang，使用Saitou的方法在研究中發(fā)現(xiàn)，體外受精過程中，人造的原始生殖細胞不能像自然狀態(tài)下產(chǎn)生的原始生殖細胞一樣，抹去它們的表觀遺傳標記。“我們必須要知道，這些都是PGCs的類似細胞，而不是真正的原始生殖細胞，”他說。

此外，這項技術(shù)還存在兩個大的挑戰(zhàn)。首先是在不將PGCs放回睪丸或卵巢的前提下買入和使它們變成成熟的精子和卵子，Hayashi目前正在試圖破解PGCs生成卵子或精子的生物信號，使人工培育條件下完成這一階段成為可能。

但zui可怕的挑戰(zhàn)是在人體重復(fù)上述所有的工作。該小組已經(jīng)在利用Saitou找到的關(guān)鍵調(diào)控基因來調(diào)整人類的iPS細胞，但是Saitou 和Hayashi都知道，人類的信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不同于小鼠。此外，Saitou有無數(shù)的小鼠胚胎進行解剖，但無法在人類胚胎進行相應(yīng)的實驗步驟。幸運的是，他們得到了長達5年共1.2億日元的資助，每周可以獲得20個猴子胚胎。Hayashi表示如果一切順利的話，他們可以在5-10年內(nèi)在猴子身上完成所有的工作。隨后經(jīng)過一些小的調(diào)整，這種方法就可以用來生物試劑人類原始生殖細胞。

但是利用原始生殖細胞治療人類不孕不育仍將是一個巨大的跳躍，許多科學(xué)家對此持有相當(dāng)謹慎的態(tài)度，這當(dāng)然包括Saitou在內(nèi)。iPS和胚胎干細胞在培養(yǎng)過程中常常會出現(xiàn)染色體異常、基因突變等現(xiàn)象。“如果在整個過程中出現(xiàn)一點差錯，都可能產(chǎn)生深遠的、多代的不良后果。” Moore說。

證明該技術(shù)在猴子實驗中時安全的，將打消人們的顧慮。但又有新的問題隨之而來，要有多少健康的猴子出生，才能證明這個方法是安全的？實驗需要觀察多少個猴子世代？

zui終，還是需要人類胚胎進行測試，而這一進程勢必會受到胚胎研究倫理問題的限制。近年來，新的非侵入性成像技術(shù)，將幫助醫(yī)生對胚胎質(zhì)量的好壞進行排序。這種人造胚胎可以利用類似于正常的體外受精胚胎的植入方式進入母體。這些有可能在胚胎研究態(tài)度較為寬泛的地區(qū)實現(xiàn)。

當(dāng)技術(shù)準備完成，挑戰(zhàn)生殖的更大壯舉也是有可能實現(xiàn)的。舉例來說，人的皮膚細胞理論上可以被用來創(chuàng)造與伴侶精子配對的卵細胞，然后植入子宮孕育。但是存在這樣的懷疑，有些事情似乎永遠無法實現(xiàn)——科學(xué)家協(xié)會的Hinxton團隊認為從男性XY細胞很難獲得卵細胞，同理，女性的XX細胞，也很難培養(yǎng)成為精子。

Saitou用雄性小鼠iPS細胞制造出了精子，利用雌性小鼠制造出了卵細胞，他曾表示反過來也是可能的。如果是這樣的話，同一只小鼠產(chǎn)生的卵細胞和精子受精，就會產(chǎn)生，以前從未見過的東西：自交小鼠。Hayashi和Saitou都不愿意嘗試這個。“如果有充分的科研理由，我們只會在小鼠身上這么做，”Saitou說。但眼下，他還沒有看到這樣的理由。

這兩位科學(xué)家已經(jīng)感受到樣本和資金的壓力，這項技術(shù)可能是無法做試管嬰兒的婦女或者是無法產(chǎn)生精子或卵子的人的zui后希望。Hayashi表示真正可行的不孕不育治療方案可能要在10年甚至50年的未來方能實現(xiàn)。“在我看來，那是很遙遠的事，我不想給人們不現(xiàn)實的希望，”他說。

許多不孕不育患者只看到了zui終的結(jié)果——小鼠實驗的成功——但卻忽略了多年艱苦細致的工作。Hayashi說，他們沒有意識到，人類胚胎與小鼠差異非常之大，從小鼠到人類就意味著這一切幾乎是從零開始。（轉(zhuǎn)自 生物探索）